ex- my - space.

1. 샘플 준비

ㄱ. 농도 (단백질용)
a. 최소 50uM이상으로 준비할 것(15N-HSQC)
* 적당히 200uM에서 500uM정도면 2D HSQC titiration하기에 편함.  
b. 3D 실험(단백질용)를 위해서는 0.6mM이상으로 준비할 것(1mM이 권장)

ㄴ. isotope labeling
a. 15N only :
* 단백질 3차구조여부를 체크해볼때 (15N HSQC)
* 간단한 titration(15N HSQC)
* dihedral angle 을 측정할때(HNHA)
* 15N-noesy, tocsy
b. 13C, 15N : 3D실험으로 구조를 구할 때(보통 8-20kDa)
c. unlabeled : 1D실험용.
d. 2H, 13C, 15N : 40kDa이상의 큰 단백질

ㄷ. 버퍼
a. 농도: 대략 5mM ~100mM 정도, 버퍼를 아예 쓰지 않는 경우도 있다.
b. 종류 : pH에 따라 알맞은 버퍼를 쓰면된다.
* proton을 가지지 않는 buffer : 예) NaPi, sodium acetate
* detrium으로 치환된 buffer : 예) D-Tris
* proton을 가지고 있지만, 문제없는 buffer : HEPES, MOPS, MES
# tris를 그냥 사용해도 되기는 하지만, 권장은 안함 --> Dynamic range

ㄹ. salt
* 일반적으로 0-500mM 정도.
* 단백질이 안정한 salt농도를 사용하는 것이 좋다.
* salt농도가 높을 수록, tuning이나 shimming이 쉽지 않으니 가급적 낮은 게 좋다.
# cryoprobe의 경우 high salt는 치명적이므로 가급적이면 salt를 쓰지 않거나, 50mM NaCl이하로 쓰는 것을 권장. buffer도 HEPES같은 버퍼를 권장.

ㅁ. additive
* DTT : cys-cys disulfide결합이 있다면 첨가해 주는 것이 좋음.
* EDTA : 금속이온을 제거해야 될경우에 첨가. Proton이 peak로 나올 수 있으나 구별가능하므로 큰 문제는 없음. 샘플을 장기보관할때도 첨가해줌(metal protease를 방해한다)
* NaN3 : 박테리아 방지용. 장기보관할 때 넣어줌.
* DSS : 내부 리퍼런스용(즉, 0 ppm맞출때). 보통 물 피크로 리퍼런스를 잡으므로 동일조건에서 실험을 한다면 딱히 넣을 필요는 없음.

ㅂ. D2O
* lock을 잡기 위해 필요. 5-10%정도를 첨가해주면 된다.

ㅅ. NMR cell
a. 종류
* Normal cell : 권장 부피 - 400ul ~ 600ul  
* sigemi cell : 권장 부피 - 200ul ~ 350ul

b. 주의 사항
* cell 표면에 상처가 없는지 확인할 것. 상처가 있으면 shimming하기 괴롭다.
* 삐뚤어져 있는지 확인할 것. 오븐에서 말리면 이런 경우가 있으니 오븐에서 건조는 삼가할 것.
* Normal cell의 경우 뚜껑에 이물질이 있을 수 있으니 미리 씻어둘 것
* Schemi cell의 경우 샘플을 넣어준 후, degassing을 해주어야 한다.
# 건조는 진공을 이용하던가(pump이용), 압축공기(혹은 질소)로 말려준다.
# degassing은 진공을 이용해서 해야 한다.

c. 샘플 담기
* 잘 말린 cell이라면 벽을 따라 피펫으로 흘려주면 샘플이 바닥까지 쉽게 도착한다.
* 가느다린 피펫을 이용해서 바닥에 직접 넣어줄수도 있다.
* 샘플을 넣다가 중간에 막히면 털어서 바닥까지 보내도 되지만, air bubble이 많이 들어가니
가능한 피하거나, degassing을 해준다. 압력이나 산소에 약한 단백질은 침전될 수 있으니 주의할 것
* 뚜껑을 덮은 다음에는 파라필름으로 sealing해준다.
* cell에는 꼭 labeling을 하길 권장.